PREGUNTAS FRECUENTES
- ¿Cómo se sintetiza un oligo?
- ¿Qué es la escala de síntesis?
- ¿Qué es la eficiencia de acoplamiento?
- ¿Por qué es importante la eficiencia de acoplamiento?
- ¿Qué es el grupo tritilo?
- ¿Cómo se mide la eficacia de acoplamiento?
- Cuando hago un pedido de un mayor número de oligos, a veces algunos de ellos se retrasan - ¿por qué es esto?
- ¿Cuál es el plazo de entrega de los oligos?
- ¿Necesito purificar mi oligo?
- ¿Por qué el rendimiento de oligos con modificaciones es menor?
- ¿Tiene mi oligo un grupo Fosfato en el extremo 5’?
- ¿Cómo son los pellets de oligonucleótidos?
- ¿En qué resuspendo mi oligo y que concentración debería hacer?
- ¿Cómo es mi oligo de estable una vez resuspendido?
- ¿Qué documentación recibiré con mis oligos?.
1. ¿Cómo se sintetiza un oligo?
Los Oligos se sintetizan utilizando un sistema de suministro de reactivo controlado por ordenador. La primera base está unida a un soporte sólido, por lo general una perla de vidrio o poliestireno, que está diseñado para anclar la creciente cadena de ADN en la columna de la reacción. La síntesis de ADN consiste en una serie de reacciones químicas.
I) Desbloqueo |
La primera base, unida al soporte sólido a través de un enlace químico, se desprotege mediante la eliminación del grupo protector tritilo. Esto produce un grupo OH 5 ' libre para reaccionar con la siguiente base. |
II) Acoplamiento |
La siguiente base se activa y se acopla al extremo 5 ' -OH- de la última base de la cadena. |
III) Capping |
Concluído el paso de acoplamiento, se bloquean todos los hidroxilos que no reaccionaron con la nueva base, esto mediante una reacción de acetilación. |
IV) Oxidación |
Finalmente, el grupo fosfito internucleotídico se oxida a un grupo fosfato estable. |
Cada ciclo de reacciones da como resultado la adición de una única base de ADN. Una cadena de bases de ADN puede construirse mediante la repetición de los ciclos de síntesis hasta que se consigue la longitud deseada
2. ¿Qué es la escala de síntesis?
Escala de síntesis se refiere a la cantidad de monómero unido al soporte utilizado para iniciar la síntesis de ADN, no a la cantidad de material final sintetizado. Cuando se especifica una escala de síntesis de 40 nmol, significa que se añaden al sintetizador de ADN aproximadamente 40 nmoles de la primera base. Para un promedio de 25 -mer, al menos el 25 % de este material de partida dará lugar a secuencias de fallidas, por lo que no es posible producir 40 nmoles de producto a una escala de 40nmol. Las pérdidas de producto se producen durante la síntesis, procesamiento post- sintética, la transferencia de materiales y el control de calidad.
3. ¿Qué es la eficiencia de acoplamiento?
La eficiencia de acoplamiento es una forma de medir cómo de eficientemente une el equipo nuevas bases a la cadena de ADN. Si todas las bases se unieran de forma 100% eficiente a la cadena de ADN, la eficacia de acoplamiento sería 100 %. Pocas reacciones químicas son 100 % eficientes. Durante la síntesis de ADN, la máxima eficiencia de acoplamiento que se puede obtener es normalmente alrededor de 99 %. Esto significa que en cada etapa de acoplamiento aproximadamente el 1 % de las bases disponibles no logran reaccionar. La eficiencia de acoplamiento está influenciada significativamente por la calidad de la materia prima, por los equipos y por los protocolos de síntesis utilizados. El sistema de QC de Metabion (control de calidad) se asegura de que cada nuevo lote de productos químicos pasa máquinas de control de calidad estrictos y los ciclos de síntesis están perfectamente ajustados al tipo de oligo.
4. ¿Por qué es importante la eficiencia de acoplamiento?
La eficiencia de acoplamiento es importante porque los efectos son acumulativos durante la síntesis de ADN. Tabla 1 muestra el efecto de una diferencia de 1 % en la eficiencia de acoplamiento y cómo esto influye en la cantidad de producto de longitud completa disponible después de la síntesis de diferentes longitud de oligos. Incluso con un oligo relativamente corto de 20 bases, una diferencia de 1 % en la eficiencia de acoplamiento puede significar un 15 % más de producto de longitud completa.
Effect of coupling efficiency on % full-length product following DNA synthesis |
||||
No. of bases added |
99% Coupling |
98% Coupling |
||
|
full-length |
Failures |
full-length |
Failures |
1 |
99 |
1 |
98 |
2 |
2 |
98.01 |
1.99 |
96.04 |
3.96 |
3 |
97.03 |
2.97 |
94.12 |
5.88 |
10 |
90.44 |
9.56 |
81.71 |
18.29 |
20 |
81.79 |
18.21 |
66.76 |
33.24 |
30 |
73.97 |
26.03 |
54.55 |
45.45 |
50 |
60.50 |
39.5 |
36.42 |
63.58 |
90 |
38.49 |
61.51 |
14.67 |
85.33 |
La tabla también muestra que cuanto más largo es un oligo menor rendimiento se obtiene, debido a las limitaciones establecidas por la química. Aún teniendo un 99 % de eficiencia de acoplamiento (lo que no es muy probable, en la práctica debemos asumir una eficiencia promedio de acoplamiento del 98,5 %), el producto bruto de una síntesis 95mer consistiría en sólo el 38,5 % de oligonucleótidos de longitud completa. La separación de longitud y secuencias completas de fallidas se obtiene por purificación por HPLC.
5. ¿Qué es el grupo tritilo?
Cada base de ADN añadida durante la síntesis de ADN tiene un grupo protector tritil dimetoxi (tritilo) unido en la posición 5'- hidroxilo. Este DMT (tritilo) grupo lábil en medio ácido del monómero unido al soporte protege la base experimenten reacciones químicas no deseadas durante el ciclo de síntesis y se elimina en el primer paso de cada ciclo de síntesis inmediatamente antes de se añade una nueva base, hasta elongación de la cadena se completa. El grupo tritilo del extremo permanece o se quita, dependiendo del método de purificación elegido.
6. ¿Cómo se mide la eficacia de acoplamiento?
El grupo tritilo es incoloro cuando está unido a una base de ADN, pero da un color naranja característico una vez retirado. La intensidad de este color puede ser medido por espectrofotometría UV y está directamente relacionada con el número de moléculas tritilo presentes. Después de la primera etapa de acoplamiento, la cantidad de tritilo liberado durante el desbloqueo es directamente proporcional a la cantidad de longitud completa oligo hecho en el ciclo anterior. Cuando el tritilo se escinde durante la etapa de desbloqueo, el catión tritilo resultante es de color naranja. La intensidad de este color puede ser medida por espectrofotometría UV. Mediante la comparación de las intensidades de tritilo producido después de la primera y última ronda de acoplamiento, se puede calcular la eficacia de acoplamiento promedio por ciclo y por lo tanto la eficacia de acoplamiento final.
7. Cuando hago un pedido de un mayor número de oligos, a veces algunos de ellos se retrasan - ¿por qué es esto?
La síntesis de ADN es un proceso complicado que ha mejorado significativamente en los últimos 10 años. A pesar de estas mejoras, todos los fabricantes tienen una tasa de fracaso inherente. Estamos constantemente desarrollando nuestros procesos y sistemas para minimizar estas pérdidas, sin embargo, es inevitable que de vez en cuando tengamos que volver a sintetizar algunos oligos.
8. ¿Cuál es el plazo de entrega de los oligos?
Los oligos estándard no modificados (< 33 bases) pedidos antes de las 6 pm, hora alemana serán enviado al siguiente día hábil a Laboratorios Conda. Los oligos con purificación HPLC, más largos o con modificaciones necesitan un día hábil adicional para estar listos para el envío. Si sucede que un oligo no pasa el control de calidad tiene que ser resintetizado. En esos casos tenemos que pedir disculpas por un aumento de 1-2 días en el plazo de entrega.
9. ¿Necesito purificar mi oligo?
Esto depende de la complejidad (longitud, composición de bases, modificaciones) de la molécula solicitada, así como de la aplicación deseada. Las Secuencias incorrectas pueden ser generadas tanto durante como después de la síntesis. Debido a la naturaleza de la química de síntesis (eficiencia de acoplamiento < 100 %) y / o procedimientos de modificación post- sintéticos, quedarán secuencias incorrectas (NX), modificadores libres y producto no marcado, respectivamente, en el producto sin purificar.
Recomendamos encarecidamente que todos los oligonucleótidos más largos de 80 nucleótidos modificados sean sometidos a purificación RP- HPLC, sin importar la aplicación.
Para aplicaciones "críticas", como la síntesis de genes subclonación , mutagénesis.. se recomienda la purificación por HPLC para oligos > 45 nucleótidos .
10. ¿Por qué el rendimiento de oligos con modificaciones es menor?
Muchas de las amiditas modificadas son menos estables y no acoplan de forma tan eficiente como las bases no modificadas (a pesar de que pueden usarse procedimientos de acoplamiento más largos, por lo tanto las secuencias incorrectas son más abundantes que en la síntesis normal. En consecuencia, la mayoría de los oligos modificados deberían ser purificados por HPLC para eliminar estas secuencias incorrectas. El rendimiento se reduce como consecuencia de la purificación. El producto final, aunque con un menor rendimiento, es mucho más puro y se asegura que el producto entregado tiene al 100 % modificado.
11. ¿Tiene mi oligo un grupo Fosfato en el extremo 5’?
Salvo que se solicite, los oligos se sintetizan sin ningún fosfato en 3'o 5'.Está disponible como una modificación adicional.
12. ¿Cómo son los pellets de oligonucleótidos?
Hay un grado normal de variación en la apariencia de los pellets secos de oligonucleótidos suministrados. Variación en apariencia per se no indica un defecto de calidad. En general, la apariencia puede variar de polvo a hialoidea. El color de los pellets de oligos no modificados puede variar de transparente a blanquecino y amarillento a bronceado. Los pellets de oligonucleótidos marcados son de color de acuerdo con el tinte que lleven.
13. ¿En qué resuspendo mi oligo y que concentración debería hacer?
El agua purificada, el TE o cualquier tampón biológico son aceptables como diluyentes. El volumen de diluyente recomendado es de 100ml - 1 ml, la concentración en función de la aplicación que se utiliza y el rendimiento del producto resultante. Concentración estándar para PCR es de 0,1 mM.
14. ¿Cómo es mi oligo de estable una vez resuspendido?
Si se utiliza diluyente estéril para resuspender el oligo, será estable a 20 ° C durante varios días a semanas, si se mantiene a 4 ° C aproximadamente un mes. Si se almacena congelado a -20 ° C o -70 ° C, se mantendrá estable durante varios meses, incluso años. Se debe evitar reiteradas congelación-descongelación, ya que desnaturaliza el oligo. Evite el uso de agua destilada, ya que la solución puede llegar a un pH de 4.5.
Para oligonucleótidos modificados - especialmente para oligos con fluoroforos – además de los consejos anteriores también se debe minimizar la exposición a la luz.
15. ¿Qué documentación recibiré con mis oligos?.
La etiqueta en el tubo del oligo muestra información básica como el nombre de oligo, nombre de la persona que lo pidió, secuencia del oligo incluyendo modificaciones, oligo ID, cantidad de ADN ( OD260 ) , Tm , y el peso molecular.
Además usted recibirá una hoja de datos técnicos que contiene información más detallada sobre las propiedades físico- químicas del oligo, como la composición de bases, contenido en GC, escala de síntesis, el grado de purificación, control de calidad y estado del envío. Si se ha pedido la purificación HPLC también recibirá una copia impresa del cromatograma preparativo.
Si bien, todos y cada oligo pasan por MALDI o ESI-ToF antes de enviarlos, la documentación solamente se proporcionará si se solicita en el momento de la realización del pedido. Se pueden aplicar cargos adicionales. La siguiente terminología se utiliza para diferenciar entre las opciones de control de calidad que se ofrecen, incluyendo la cobertura respectiva documentación en nuestros formularios de pedido y en el apoyo a los documentos entregados con los productos:
Mass Check
El control de calidad estándar que se hace a cada oligo. Sin documentación impresa/pdf proporcionado. Gratis.
MALDI-ToF
Solo se hace bajo pedido. Se aplican cargos adicionales.
ESI-ToF
Solo se hace bajo pedido. Se aplican cargos adicionales.
Mass Check + Analytical HPLC
Solo se hace bajo pedido. Se aplican cargos adicionales.